大鼠臍帶間充質干細胞

冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗操作步驟：  公司產品僅用于科研，不得用于臨床．
a．采用認可的方案處死嚙齒動物。    
b．立即在無菌超凈臺內用70％乙醇擦洗整個動物。  
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。   
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。   
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。   
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。

?

實驗材料： 
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 
2. 100ml滅菌燒杯2個； 
3、50ml離心筒2個 
4、滅菌培養皿1個，細胞培養瓶1個 
5、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個 
6、細胞計數板1塊； 
7、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把； 
8、酒精燈1臺；
細胞培養的優點：
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中，根據要求可始終保持細胞活力，并可長時間監控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態、結構、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學的條件，可以根據實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養一定代數后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學、原位雜交、同位素標記等各種儀器設備 
記錄方式可采用攝影照片、縮時電影、電視等多種手段。
5.研究的范圍比較廣泛
應用的學科領域較為寬廣，如細胞學、免疫學、腫瘤學、生物化學、遺傳學、分子生物學等；
適用的對象范圍廣，從低等動物到高等動物，一種動物的不同年齡階段以及不同組織，都可進行有針對性的研究。
6.研究的費用相對較經濟
可提供大量、同一時期、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象。

?

細胞凍存：
對培養的細胞進行凍存的最佳方法是將細胞置于含有(DMSO)等冷凍保護劑的*培養基中于液氮中儲存。冷凍保護劑可降低培養基的冰點，并可減緩冷卻速度嗎，大大降低冰晶形成的危險  (冰晶可損傷細胞，導致細胞死亡)。
注：DMSO 可促進有機分子進入組織。操作含DMSO的試劑時，應采用與此類物質安全危害相適應的設備和操作規范，并應按照當地法規處置此類試劑。 
細胞凍存指導原則
凍存細胞系以備將來之用時，必須遵守以下原則。與其他細胞培養操作一樣，我們建議您嚴格遵守您所用細胞系附帶的操作說明，以便獲得最佳結果。 
1）在高細胞濃度情況下進行培養細胞的凍存，并且細胞傳代次數盡可能少。確保凍存前活細胞百分比至少為90%。請注意最佳凍存條件取決于所用細胞系。 
2）細胞應緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器使溫度每分鐘大約降低1°C。
3）必須使用推薦的凍存培養基。凍存培養基中應含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護劑
4）將冷凍的細胞于 -70°C 以下溫度儲存；溫度高于 -50°C 時，冷凍的細胞將開始變質。 
5）必須使用無菌凍存管儲存冷凍的細胞。裝有冷凍細胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內保存 
6）必須穿戴個人防護設備。 
7）所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態。必須采用正確的無菌技術，并且在層流通風櫥內進行。
SV40轉化的非洲綠猴腎細胞;COS-7TRIS-HC1BuffersolutioIS-HC1緩沖液100克IND，80%

293[HEK-293]細胞，人胚腎細胞 人盲腸腺癌細胞(未分化),Hce-8693細胞 CM-R013大鼠肺大靜脈內皮細胞*培養基100mL間拂肖基本 1-Fluoro-3-nitnobqnzqnq 40-67-2

大鼠雪旺細胞;RSC96N-R添加劑shēng huà shì jì容量：RT，避光25克

ENPP7 Others Human 人 ENPP7 / NPP-7 人細胞裂解液 (陽性對照) STPP三聚嶙酸鈉1克工藝級，90%

大鼠骨髓瘤細胞;Y3-Ag 1.2.396-98-04-甲基-3-硝基本4-metxyl-3-nitnobenzoic acid
Eca-109(人食管癌細胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0246YAC-1(小鼠瘤細胞)5×106cells/瓶×2 中國倉鼠肺細胞;V79細胞弛素E(>98%，BR)Cytochalasin E質量規格：>98%，BR

小鼠誘導性多潛能干細胞;PUMC-mips-A5D-樟腦酸(>99%,BR)D-(+)-Camphoric acid質量規格：>99%,BR

CRIP2 Others Human 人 CRIP2 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) D(+)-二苯甲酰1酸一水(>98%，BR)D-(+)DBTA, Dibenzoyl-D-tartaric acid, monohydrate質量規格：>98%，BR

原代系膜細胞特制無血清添加劑Many types of cells包裝：1ml己二11酸二胺(>98%，BR)DATD, (+)-N,N'-Diallyltartramide質量規格：>98%，BR

mCF, 小鼠心臟成纖維細胞 小鼠雜交瘤細胞，7F2細胞 EL4. IL-2(瘤細胞)十二1基丁二1(>98%，BR)DDSA, dodecenylsuccinic anhydrous質量規格：>98%，BR
大鼠臍帶間充質干細胞AM(人腺樣囊性癌細胞(高轉移)) 5×106cells/瓶×2 綠色熒光蛋白標記小鼠前胃癌細胞;MFC-GFP鹽酸貝他定(進口)Bestatin HCl質量規格：≥98%,美國進口

人表皮色素細胞-中色素總RNAHEM-m NAN-十八烷酰二氫-D-赤-鞘氨醇N-Stearoyldihydro-D-erythro-Sphingosine質量規格：美國進口

SERPINB4 Others Human 人 SerpinB4 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) Fmoc-3-苯甲酰-赤-鞘氨醇Fmoc-3-benzoyl-erythro-sphingosine質量規格：美國進口

敘利亞倉鼠腎細胞;BHK-21D-赤-鞘氨醇(硫酸)D-erythro-Sphingosine (sulfate)質量規格：美國進口

BEL-7404細胞，肝癌細胞 人膜腺癌細胞,HEC-1-B細胞 小鼠肺腺癌低轉移細胞(VAP33-GFP融合蛋白穩定過表達);LA1-VAP33-GFPD-赤-鞘氨醇-1-1酸鹽D-erythro-Sphingosine-1-phosphate質量規格：美國進口
實驗操作：
1、培養瓶預包被。試驗前一天預包培養瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。
2、取材：正常成年大鼠腹腔注射5%麻醉，75%酒精浸泡，無菌條件下迅速取出大鼠主動脈。
3、材料預處理：將獲取的血管放入含有1% P/S的1 × PBS （pH 7.4 ）中反復洗滌，去除血管外部的洗滌液澄清，用無菌鑷子剝去外膜面的殘留組織。PBS洗滌凈。
4、除去內皮細胞：將血管縱向剪開， 內膜面向上，無菌鑷子沿中軸方向反復刮動內膜層4-5遍，去掉內皮細胞，用1 × PBS （pH 7.4 ）洗滌3次。
5、分離中膜：將去掉內膜的血管，繼續刮動分離中膜，去掉外膜，用眼科剪將內膜剪碎為1×1mm3的小塊，加入1 × PBS （pH 7.4 ），轉移到15ml 離心管中，PBS洗滌3次，離心收集沉淀物。
6、消化：在洗凈的內膜碎塊中加入消化酶液，將離心管放入37℃水浴消化15min。
7、終止消化：吸出消化液入新的離心管中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應；余下的組織繼續加入消化液，消化15min ，重復消化3次。
8、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養液重懸，染色計數細胞。
9、培養細胞密度：調整細胞密度以5 × 105個/ml 接種入培養瓶。
10、培養：放置于37℃，5% CO2培養箱中。